在标准的双光子显微镜中，很难区分不同类型的细胞或结构。为了解决这个问题，目前是使用在光谱上可以区分的荧光染料标记要跟踪的结构，通过双光子荧光成像来区分细胞和结构。然而，这些有效的荧光团通常具有广泛分离的激发光谱，大多数荧光团具有约50nm宽的激发光谱带宽，所以需要使用不同波长的脉冲激发它们，并且使用的激发脉冲应在中心波长上至少分离100nm。

目前，波长可调的钛宝石飞秒激光器经常被用来依次激发多个荧光团。但是在波长调谐和重复扫描期间，较长的扫描时间可能会导致样品不稳定；顺序激发会使成像速度变慢。因此，迫切需要开发一种能够同时为双光子荧光显微镜提供多种激发波长的光源。

光纤激光器通常比固体激光器便宜得多，结构紧凑、，稳定。为了同时激发光谱上不同的荧光团，目前已在光纤中实现了各种非线性波长转换的方案，包括孤子自频移、参量放大、自相位调制和拉曼激光。基于孤子自频移的光源用于显微镜成像时，拉曼孤子的定时抖动可能会显著增加测量的噪声。

基于四波混频和自相位调制的系统均需用到光子晶体光纤，系统复杂，光纤集成具有挑战性。拉曼激光中的拉曼位移受到二氧化硅中13THz斯托克斯位移的限制。在用掺镱光纤激光器泵浦的拉曼激光器中，驱动脉冲接近1030nm，拉曼激光被限制在大约1080nm，不是成像的最佳波长。

增益管理非线性放大显著扩展了掺镱光纤放大器可实现的带宽，在这种技术中，放大器由相对窄带的脉冲作为种子，然后在移向更长波长的同时光谱展宽约100倍，能实现1030nm到1180nm的宽带脉冲，且可压缩到接近变换极限。脉冲的带宽和能量受到受激拉曼散射（SRS）的限制。如果超过该限制，则脉冲能量的很大一部分被频移到斯托克斯光中，这个过程是非相干的，因为它是由噪声造成的。

最近，康纳尔大学Frank Wise教授课题组描述了一种同步泵浦拉曼光纤激光器，能在1050nm和1200nm处产生脉冲。拉曼激光器的概念设计如图1所示，短脉冲种子激光器和掺镱光纤一起充当增益管理非线性放大器，在1200nm附近发生自发拉曼散射产生斯托克斯光。1150nm的二向色镜在增益光纤之后将脉冲波长未红移的部分耦合出腔，。半波片和偏振分束器用来调节输出能量。1200nm的长通滤波器进一步滤出斯托克斯光，斯托克斯光通过延迟线传播进一步返回增益光纤，延迟线使其与种子同步，并在进入放大器时与种子重新组合，从而在1200nm处提供正反馈。在没有反馈的情况下，斯托克斯光的能量非常低，并且是非相干的。然而，在反馈存在的情况下，能既提高斯托克斯光的相干性，又显著增加其能量。

图1 基于增益管理放大的同步泵浦拉曼激光器[1]

在这项工作中，该组使用增益管理非线性放大将一阶斯托克斯峰移到1200nm，1200nm处的腔正反馈使该处的斯托克斯光不断被放大。然后滤出未位移的脉冲以增加脉冲的光谱分离，从而在1050nm和1200nm处获得能量为∼24和∼15nJ的脉冲。最终通过对小鼠大脑成像并检测血管、神经元和其他细胞结构，证明了该系统在三色双光子成像中的实用性。

图2 压缩的未位移脉冲（a）和压缩的斯托克斯脉冲（c）的强度自相关，相应的光谱分别显示在（b）和（d）中[1]

参考文献

[1] Michael L. Buttolph, Menansili A. Mejooli, Pavel Sidorenko, Chi-Yong Eom, Chris B.Schaffer, and Frank W. Wise, "Synchronously pumped Raman laser for simultaneous degenerate and nondegenerate two-photon microscopy," Biomed. Opt. Express 12, 2496-2507 (2021)

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之二十八 同步泵浦拉曼激光器用于驱动双光子荧光显微镜