对活体生物样品的三维观测是了解细胞功能的重要方法之一。目前已有的三维荧光成像技术包括光片显微成像技术、晶格光照明技术以及激光扫描显微成像技术(如共聚焦显微镜及双光子显微镜)等。其中激光扫描显微镜利用旋转盘可以进行多焦点的激光扫描,提高时间分辨率,而且有利于减少活细胞成像中的光损伤。

本篇文献主要实现了可见光双光子激发及多焦点激光扫描的结合,最终提高了活体3D延时扫描中的空间分辨率及成像对比度,同时这也是可见光双光子激发(v2PE)在超高分辨率显微镜中的首次应用。

图1 可见光双光子荧光显微镜系统示意图

系统示意图如图1所示,红外激光束从蓝宝石激光器出射后,由一个光学参量振荡器(OPO)转化到可见光波段,产生的可见光脉冲宽度为200 fs, 重复频率80 MHz,波长在490-750nm范围内可调谐。光束通过透镜及平面镜中继到包含微透镜阵列盘和针孔阵列盘的共聚焦扫描单元中,形成用于荧光激发的多焦点光束。多焦点光束通过一个硅油浸润的物镜成像到样品上,激发荧光信号。荧光信号由同一个物镜收集并传输到针孔阵列圆盘,产生共焦效应,隔离来自焦平面外的杂散光。

之后,荧光信号由一个截止波长为506 nm的定制长程双色镜从激发信号中分离出来,并由一台EM-CCD相机进行检测。系统中微透镜阵列盘和针孔阵列盘以每分钟4500转(rpm)的速度旋转,EM-CCD相机可以在6．67 ms的时间内得到样品的荧光分布。同时,用一个单轴移动的的压电平台轴向扫描,获得荧光信号的三维分布。实验中用到的物镜有两种规格:100×/NA 1．35和60×/NA 1．3,使用时对应的小孔直径分别为0．62AU及1．0AU(艾里单位)。

图2 (a)荧光珠子的荧光图像及谱线轮廓。(b)检测路径中PSF和OTF计算方法的示意图说明。(c),(d)计算v2PE和1PE多聚焦显微镜的PSFs。(e) x(上)和z(下)方向上(c)和(d)的谱线轮廓。(f),(g)计算了v2PE和1PE多聚焦显微镜的OTF。(h)计算得到的PSFs在x(下)和z(上)方向上的针孔尺寸与FWHM的关系

实验从理论和实验上评估了多焦点v2PE显微镜的空间分辨率,并与单光子荧光显微镜进行了对比,实验及模拟结果见图2。实验中v2PE的激发波长为521 nm,使用放大倍率为100倍的物镜,针孔尺寸为0．6AU,对直径100nm的荧光颗粒进行了测试性成像,共获得40幅不同采样深度的图像合成为三维图像。图像在横向和纵向的半高全宽分别是177 nm和297 nm,这些值接近显微镜的理论分辨率。后续还利用软件模拟从理论上研究了多焦点v2PE显微技术的空间分辨率,模拟计算显示v2PE点扩散函数(PSF)的横向半高宽与单光子激发荧光(1PE)相似,轴向的半高宽较1PE减少,可以提高空间分辨率。

通过比较两者的光学传递函数(OTF),可以得出v2PE成像上较1PE成像保留了更多细节。此外,还模拟计算了PSF对针孔大小的依赖性:轴向上,v2PE点扩散函数的半高宽基本不受针孔直径的影响,并且一直都小于1PE;而在横向上,针孔尺寸在0．4-2．0AU范围时v2PE与1PE的FWHM相似,当小于0．4AU时,v2PE的横向分辨率就会高于1PE。但实际情况下使用尺寸过小的针孔会使得可用光子数不足,所以二者横向分辨率基本相同。

图3活海拉细胞中高尔基体及纤颤蛋白的时间分辨荧光图像

为了验证动物生物样品的时间分辨成像能力,本实验观察了活海拉细胞高尔基体中的青色荧光蛋白mTFP1,见图3(a),(c)-(i)。使用的物镜及针孔尺寸与荧光颗粒成像一致,对比可见v2PE在空间分辨率、激发深度级图像对比度较常规宽场显微镜(图3(b))都有所提高。此外,v2PE可以同时激发多个波长的荧光蛋白,这种技术还可以应用于细胞内分子的三维动力学多色成像。

在此基础上,实验对海拉细胞中的高尔基体(mTFP1)和纤颤蛋白(EGFP)进行了在体成像,见图3(j)-(n),青色为mTFP1,绿色为EGFP,实验中两种荧光蛋白同时成像,最终采用光谱分离法将不同蛋白的荧光信号分离出来。

图4 海拉细胞在体延时三维观察高尔基体的成像结果

后续还进行了海拉细胞的活体高尔基体的三维时间分辨成像,实验使用60×/NA 1．3的硅油浸物镜及直径为1．0AU的小孔。二维图像采集的帧速率为20fps,利用样品中40个不同层的荧光图像形成3D荧光体成像,1次体成像需要2 s采集,然后重复采集18次,成像体积大小20×20×2μm(xyz)。激发波长为530 nm,激发强度为1．25×105 W/cm2,成像结果见图4。

图5 PI处理后的海拉细胞荧光图像

后续实验使用碘化丙啶(PI)来指示细胞在7、8、9和10分钟的延时观察后的损伤情况,来验证该光学系统对活细胞长期观察的适用性。在观察期间,88个焦点以100毫秒的曝光时间,曝光间隔1s照射样品,激发强度为3．21×104W/cm2,激发波长为525nm,使用前文提到的60×物镜及1．0AU孔径,图5(a)-(d)为引入PI的成像图,(e)-(h)为相应的相应衬度图。改变激发条件为每照射500ms间隔5s,得到相应的(i)-(p)。由图像可知,延时观察小于8分钟的情况下不造成可见细胞损伤,对于实际3D延时成像,由于焦平面是移动的,所以预期细胞存活时间会更长,可见这是一种在3D在体延时成像中具有很大优势的成像方案。

由于具有较高输出功率的光源可以提高成像速度,在我们的实验中,时间分辨率主要是受OPO输出可见光激光功率的限制。尽管在单点扫描系统中,v2PE激发会使得空间分辨率提高,但多聚焦v2PE显微镜具有与1PE多聚焦显微镜近乎相同的横向分辨率,这主要是多聚焦成像和单点扫描技术之间的差异造成的。由于v2PE的激发体积小于1PE,引入图像扫描技术可以进一步提高空间分辨率,这种技术需要通过在针孔阵列前引入额外的微透镜阵列来实现。除此之外,由于可见光区域的共振效应,可能会产生光漂白,因而为了延长观察时间,系统还需要对激发强度和曝光时间做进一步优化。

参考文献:

[1] Ryosuke Oketani, Haruka Suda, Kumiko Uegaki, Toshiki Kubo, Tomoki Matsuda, Masahito Yamanaka,Yoshiyuki Arai, Nicholas I． Smith, Takeharu Nagai, Katsumasa Fujita, “Visible-wavelength two-photon excitation microscopy with multifocus scanning for volumetric live-cell imaging,” J． Biomed． Opt． 25(1), 014502 (2019)