角膜是眼睛最前的部分，尽管眼内压和屈光度每天都在变化，但是角膜的机械特性使其每天都能保持相同的曲率和屈光度，而这些特性都与角膜的基质层结构密切相关。角膜基质厚度约为500 µm，由1-3 µm厚的胶原蛋白纤维堆叠而成的薄片组成。常见的成像方式如透射和扫描电镜可以分辨片层内的胶原纤维，但只能二维成像，且视场有限。相干断层扫描和反射共聚焦显微镜是临床上常用的三维成像技术，但很难分辨胶原片层，也无法显示其方向。

X射线散射已被成功用于测量角膜全厚度上胶原片层的平均取向，但不能分辨不同深度片层内的胶原取向，且横向分辨率有限。二次谐波（Second harmonic generation, SHG）显微镜是成像基于二次谐波效应，入射光束与目标分子取向轴之间的相对角度会影响SHG信号的强度。通过分析SHG信号强度与入射光束偏振态之间的关系，可以提供胶原纤维的取向信息。本文采用这种偏振分辨SHG成像（polarization-resolved SHG, P-SHG），定量研究了人体角膜的基质结构。

图1：(a) 人体角膜基质结构剖面示意图; (b) Epi P-SHG显微镜示意图; (c) 胶原纤维偏振分辨SHG信号典型图样; (d) 胶原纤维SHG信号强度分布、取向分布以及R2检验典型图样。[1]图1b是实验装置简图，旋转1/2波片可以改变入射激光的线偏振态的角度，1/4波片用于优化激光的线偏振度。图1b中与入射激光同向收集到的SHG信号（绿色箭头）称为Trans P-SHG，与入射激光反向收集到的SHG信号（紫色箭头）称为Epi P-SHG，其中Trans P-SHG的相干长度较长。

比较图1两种成像方式所得到的SHG图像、胶原纤维面内取向图和决定系数，可以发现它们之间存在较大的差异。Trans P-SHG 具有较大的相干长度，使得信号在大尺度上积累，并产生相长或者相消干扰(具体取决于该相干长度内原纤维域的相对极性），所以在图1d2中可以明显观察到片层的交叉（黄色箭头指向）。图1d3和d4显示，在epi取向图中取向相似的结构域更大，边界更光滑，而Trans取向图容易包含连续两个片层中不同方向的胶原纤维，所以更多的显示出一些颗粒状和黑色像素。因此Epi P-SHG能够更好的表征基质片层内的胶原纤维方向。

图2: (a) 鼻颞轴与上下轴位置示意图; (b-e) 角膜内不同厚度处（前基质、中基质、后基质以及全部基质）偏振分辨横向重构; (f-j) 鼻颞轴沿着x轴方向时，角膜不同厚度处的角膜取向分布极坐标图; (k-o) 鼻颞轴沿着y轴方向时，角膜不同厚度处的胶原纤维取向分布极坐标图。[1]

受益于Epi P-SHG的短相干长度，可以对角膜内胶原纤维取向进行全厚度分析。在图2中，作者将基质分为三个部分，前基质、中基质和后基质，并分析了基质不同部分中的胶原纤维取向分布，如图2f-o所示。其中图g-j是令鼻颞轴沿着x轴方向对角膜成像，图l-o是令鼻颞轴沿着y轴方向对角膜成像。从图2可以得出两点：1. 不同厚度处胶原纤维取向分布存在差异；2. 受到实验装置抖动以及样品内散射的影响，角膜后基质的测量结果并不准确，可以通过连续两次P-SHG测量（图2f和k）来减小该测量误差。

图3: (a-d) 十例人类角膜中前基质、中基质和后基质以及全部基质厚度中胶原纤维取向的极化坐标图。(e-h) 十例人类角膜胶原纤维平均分布极化图。[1]

该课题组利用该方法表征了角膜内胶原纤维取向分布，解决了这一长期悬而未决的问题。图3展示了对十例人类角膜的前基质、中基质和后基质处胶原纤维取向的分析，从中可以看出，在角膜前部，胶原纤维主要倾向于沿上下轴分布，而随着在角膜内深度的增加，主要胶原纤维取向转变至沿鼻颞轴方向。总之，本文利用Epi P-SHG显微镜的小相干长度和P-SHG对胶原取向的敏感性，以微米级分辨率连续定量描述人类角膜整个厚度的片层结构，显示了P-SHG显微镜在厚致密组织的胶原分布成像方面的独特潜力。

参考文献：

[1] Clothilde R,Anatole C,Pierre M, et al. Unveiling the lamellar structure of the human cornea over its full thickness using polarization-resolved SHG microscopy.[J]. Light, science & applications,2023,12(1).

  原文标题 : 多光子显微镜成像技术之四十二 基于偏振分辨SHG显微镜揭示人类角膜片层结构