相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微成像，允许无标记、非破坏分子成像，避免了标记对分子性质的影响，是细胞生物学中的重要研究工具。如图1所示，CARS成像需要泵浦光和斯托克斯光，两束光在空间和时间上重合，当二者之间的频率差与分子振动频率一致时，产生反斯托克斯光信号。

为了提升光谱分辨率，泵浦光和斯托克斯光一般采用波长不同的皮秒变换极限脉冲。现实中，通过被动锁模产生宽光谱飞秒脉冲更为容易，但如果泵浦光和斯托克斯光同为变换极限飞秒脉冲，则会同时激发多个分子振动，从而牺牲了光谱特异性，本期介绍的光谱聚焦技术是克服这一瓶颈的有效手段。

图1. CARS的过程[1]

光谱聚焦通过控制脉冲啁啾来优化宽带飞秒激光源的瞬时光谱宽度。如图2所示，对泵浦脉冲和斯托克斯脉冲引入线性啁啾后，啁啾脉冲具有较窄的瞬时带宽，提高了光谱分辨率。在此基础上引入不同的延迟，即可实现对于不同分子振动的激发。对于正延迟（斯托克斯脉冲在泵浦脉冲之后到达），泵浦光束的长波分量与斯托克斯光束的短波分量相重合，产生波长更长的CARS信号光，相反则产生波长更短的CARS信号光。

图2. 光谱聚焦技术[2]

在图3所示的实验装置中，钛宝石激光产生的飞秒脉冲耦合入微结构光纤中，生成用于SF-CARS的宽光谱脉冲，平均功率为280 mW。使用截止波长为775nm的双色镜DM1分离出泵浦光束和斯托克斯光，两束光的光谱如图3中插图所示。随后泵浦脉冲经过延迟线，调整时间延迟。均衡模块VGEM平衡两束光之间的群色散延迟。VGEM装置由多块不同的BK7玻璃组成，并可灵活调整光程。泵浦光束和斯托克斯光耦合到显微镜中，水浸物镜成像，焦点处的泵浦功率为16mW（光谱宽度70nm），斯托克斯光功率为23mW（光谱宽130nm），最后通过滤波片和光电倍增管收集成CARS信号。

图3. 实验光路[3]

实验结果如图4所示，样本为小鼠脂肪组织。图4中(ii)(iii)(iv)分别为CARS、二倍频以及和频图像，对应小鼠体内脂肪细胞、胶原纤维、脂肪组织吞噬细胞。(v是明场图像，(vi)为多模态成像的复合图，提供了结构分布以及局部脂肪组织结构等信息。除此之外，CARS信号的选择性在成像未知成分的样品时有着独特的优势。

图4. 基于光谱聚焦的CARS成像[3]

本篇展示了一种利用宽带飞秒脉冲产生高光谱分辨率光谱的方法，它能将全部脉冲能量用于高效产生非线性成像信号[3]。采用该方案，作者将光谱聚焦CARS成像成功地与其他非线性光学成像模态相结合，获得了良好的多模态成像结果。

参考文献：

[1] Hashimoto M . Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy[J]. ACTA HISTOCHEMICA ET CYTOCHEMICA, 2002.

[2]Mohseni Mojtaba,Polzer Christoph,Hellerer Thomas. Resolution of spectral focusing in coherent Raman imaging.[J]. Optics express,2018,26(8). M. Gebhardt, C. Gaida, F. Stutzki, S. Hädrich, C. Jauregui, J. Limpert, and A. Tünnermann, Opt. Express 23, 13776 (2015).

[3]Krzysztof P. Herdzik,Konstantinos N. Bourdakos,Peter B. Johnson,Adam P. Lister,Aleksandra P. Pitera,Chun-yu Guo,Peter Horak,David J. Richardson,Jonathan H. V. Price,Sumeet Mahajan. Multimodal spectral focusing CARS and SFG microscopy with a tailored coherent continuum from a microstructured fiber[J]. Applied Physics B: Lasers and Optics,2020,126(9).

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之二十九 基于光谱聚焦技术的CARS成像