作为深层组织和活细胞成像的强大工具，多光子显微镜可以简单分为双光子显微镜（2PM）和三光子显微镜（3PM）两种。相对于2PM，3PM有两大优势：一是使用更长波段的激发光源，让激光在生物组织中有更长的衰减距离；二是通过更高阶的非线性激发，减少背景信号的强度。基于这些优势，3PM大幅提高了多光子显微成像的穿透深度和图像信噪比。然而，构造能同时激发多种荧光团的多色3PM远比2PM更有挑战性。一般来说，能同时观察绿色和红色荧光团的双色3PM需要两种不同的激发波长，分别为1300 nm和1700 nm。使用双波长光源不仅增加了总激发功率和损伤组织的风险，也增加了光学系统的复杂性。因此，发展单一激发波长的多色3PM在生命科学研究中具有重要的实际意义［1］。

科研界普遍认为，绿色和红色荧光团的吸收峰相去甚远，但荧光团的三光子吸收谱与单光子吸收谱并不完全一致。三光子截面的峰值相对其单光子吸收峰会蓝移数百纳米，这为单一波长同时激发绿色和红色荧光团提供了基础。

图1 溶液中Texas Red、SR 101、Alexa Fluor 546、DsRed、tdTomato、mCherry Qdot 605的单光子吸收谱、双光子及三光子吸收截面

图1表示一些常见荧光染剂的单光子吸收谱、双光子和三光子截面。以红色荧光团Texas Red为例，其单光子吸收峰位于590 nm，双光子截面与单光子吸收谱类似，而三光子截面峰位于420 nm，对应跃迁到更高的能级。这说明～1300 nm的脉冲也能对红色荧光团进行有效的三光子激发。如图2所示，当激发波长低于1260 nm时，荧光团仅激发双光子信号。随着激发波长逐渐红移，激发信号会混合双光子和三光子的荧光。当波长大于1340 nm，激发信号才以三光子荧光为主。

图2 Texas Red荧光信号强度与入射激光强度取对数后的斜率与激发波长的关系

图3是不同激发波长对Texas Red标记小鼠大脑血管的多光子图像。如图所示，随着波长从1220 nm到1340 nm，三光子荧光信号的比例逐渐上升，图像的信噪比也逐渐上升。1650 nm激发的三光子荧光图像相较于1340 nm信噪比有略微的下降，原因是1650 nm的三光子截面要低于1340 nm。

图3 Texas Red标记小鼠大脑血管的多光子图像

图4 在1340 nm激发下的多色三光子荧光图像。

图4 显示了单一1340 nm波段激发的多色三光子图像。其中GCaMP6标记小鼠大脑中的神经元、Texas Red标记血管，三倍频信号则主要观察红细胞和髓磷脂。由于所有通道均为三光子激发的过程，图像信噪比优越。

总而言之，基于1340 nm的新型三光子激发方案，不仅有出色的多色成像能力，还对常见的红色荧光分子有超过10倍的信号增强。这将为三光子显微镜在生命科学应用的拓展提供新的机遇。

参考文献

［1］ Multicolor three－photon fluorescence imaging with single－wavelength excitation deep in mouse brain． Science Advances 7， eabf3531 （2021）．

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之二十二 多色三光子荧光成像技术