癌症的常规诊断通常需要结合内窥镜检查、活检和组织病理学检查，采用多光子内窥镜成像有望实现高分辨率定位癌区边缘，缩短诊断时间。多光子内窥镜一般使用压电光纤或MEMS扫描镜实现扫描，但这种微型扫描部件角度受限，也增加了装配和灭菌的难度。对于头颈部器官成像，用振镜(Galvo)实施近端扫描更为实用，而且近端的大体积器件更容易安装，在准静态模式下扫描更均匀，同时较大的倾斜角度有利于增加成像平面上的视场(FOV)和数值孔径(NA)。本文介绍用于头颈部区域的近端扫描多模态内窥镜，成像模态包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）、双光子激发荧光(TPEF)、二倍频（SHG）以及针对吲哚青绿(ICG)染色剂的单光子荧光[1]。

内窥镜如图1(a)所示，由两大部分组成，一部分是长250 mm、直径为6 mm的刚性探针内镜管，有45°和0°两种视角；另一部分是用于准静态扫描成像的扫描头(尺寸为10×12×6cm3)，扫描头内部光路图见图1(b)。激发光束由空芯光纤传输，经透镜准直后由Galvo镜实现扫描。长通滤波器F1用于过滤传输光纤中的四波混频噪声。反射镜、扫描透镜和短通二向色镜DM2反射并聚焦光束进入内镜管。非线性信号反向传输并透过DM2，经过短通滤波片F3滤除信号中的红外波段后进入收集模块。810-870 nm范围内的ICG信号沿激发光路返回，由二向色镜DM1反射后最终耦合进入单模光纤中被收集。内镜管中的光学设计见图1(c)，近端NA为0.09，远端为0.5，工作距离为160 um。CARS激发的泵浦和Stokes光对应的两个波长模式在轴向和离轴场中相互重叠，这意味着一阶色差得到了纠正，见图1(d)。从图1(e)的能量通量图中可以看出，从215 um的视场半径处开始，内窥镜管内开始出现图像虚化，当视场半径达到离轴350 um时，内窥镜管内能量损失达到60%。

图1 内窥镜系统示意图[1]

该课题组测试了系统各模态的分辨率，ICG单光子荧光分辨率测试使用了一个USAF分辨率测试靶固定在内窥管的样品端，通过对点扩散函数及边缘扩散函拟合计算，测得分辨率为800 nm，见图2。

图2 ICG单光子荧光分辨率测试系统及结果示意图[1]

非线性成像分辨率用200 um的荧光微珠测试。如图3所示，是通过测绘视野中心及离轴210 um、离轴280 um区域的点扩散函数拟合获得了不同位置TPEF的横向分辨率约为1 um，再通过轴向以0.5 um间隔移动样品微珠测得轴向分辨率为8.2 um。

图3 多光子信号分辨率测量示意图[1]

实验组对比了头颈部鳞状细胞癌荧光成像及H&E染色切片成像效果，见图4。根据图4(a)的病理组织学注解，将组织分为上皮和基质部分，对应的多模态内窥镜成像结果见图4(b)。图4(e)为4个不同模态独立成像的结果，与叠加图中的不同颜色相对应。结缔组织发生炎症的标志之一是血管增生，这会导致较高的ICG信号。另外，ICG信号还可以区分上皮内的乳突尖，其病理学结构见图4(c)，对应于图4(d)内窥镜成像结果中的青色圆泡。TPEF和SHG图像显示结缔组织细胞外基质结构蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白含量，不在上皮组织中表达。CARS信号显示组织切片形态，可以看到上皮组织的致密结构。

图4 头颈部鳞状细胞癌荧光成像及H&E染色切片成像对比图[1]

为了确认系统的烧蚀能力，在鸡肉组织切片上烧蚀一个边长116 um的正方形区域，烧灼区域CARS成像结果见下图。

图5 激光消融可行性测试[1]

综上，本文介绍了刚性探针近端扫描多模态内窥显微镜，图像最大视场可达650 um，以 1 um的分辨率成像的视场超过560 um，是目前高NA内窥镜成像系统中的最大视场，且可以同位组织消融，在术中实时诊断有很大的应用潜力。

参考文献： 

[1] Chenting Lai, Matteo Calvarese, Karl Reichwald, Hyeonsoo Bae, Mohammadsadegh Vafaeinezhad, Tobias Meyer-Zedler, Franziska Hoffmann, Anna Mühlig, Tino Eidam, Fabian Stutzki, Bernhard Messerschmidt, Herbert Gross, Michael Schmitt, Orlando Guntinas-Lichius, Jürgen Popp, "Design and test of a rigid endomicroscopic system for multimodal imaging and femtosecond laser ablation," J. Biomed. Opt. 28(6) 066004 (28 June 2023)

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之四十一 近端扫描多模态多光子内窥镜