在小型化的多光子显微镜（MPM）中，可以通过基于压电的扫描仪进行螺旋扫描、李萨如扫描或光栅扫描，或者使用微型MEMS镜进行X-Y平面扫描。为了实现小型化MPM的三维成像能力，需要深度扫描。传统上，深度扫描是通过将显微镜安装在平移台上或使用回拉机械装置实现。但是这些方法会增加仪器的尺寸并且精度低，不适合在体内应用。此外，许多研究需要将设备安装在小型哺乳动物（如小鼠）的头部进行脑成像，会有尺寸和重量限制，所以需要MPM在保持尺寸小的同时还能进行准确的深度扫描。

本期文献的工作展示了基于形状记忆合金（SMA）来实现小型化显微镜的深度扫描[1]。SMA包括镍钛基、铜基等50多种合金。所谓形状记忆效应，是指材料能够“记住”原来的形状，并在一定条件（一般为温度）下恢复初始形状的特性。SMA结构紧凑、重量轻、易于使用。当电流通过SMA时，焦耳加热可以使SMA收缩，产生足够的拉力移动显微镜内的光学器件来改变光束焦点，进而实现显微镜的深度扫描。SMA深度扫描仪不仅尺寸小，能提供相对长的扫描范围和高响应速度。

图1展示了该多模态显微成像系统[1]。作者使用掺铒光纤激光器作为光源，该激光器的中心波长为1580 nm，脉宽为~80 fs，重复频率为~47MHz，平均输出功率为~230 mW。进一步将1580nm脉冲通过PPLN晶体倍频到790nm，效率约为35%。790nm的脉冲用于激发双光子激发荧光（TPEF）和二倍频（SHG）信号，而1580nm的脉冲用于激发三倍频（THG）信号。L1和L2分别用于将激光束聚焦到PPLN中并准直从PPLN发出的光束。两个消色差透镜L3和L4分别用作显微镜的扫描透镜和管透镜，MEMS镜实现XY扫描。SMA深度扫描仪驱动定制设计的物镜进行深度扫描，物镜由非球面透镜和平凸透镜组成。来自样品的发射信号通过物镜被多模光纤收集，进一步传送到PMT中进行成像。

图1 多模态多光子显微成像系统的装置[1]

图2展示了SMA驱动物镜的设计。物镜的非球面透镜连接到SMA制动器，该制动器能使透镜平移370µm。平凸透镜保持静止，确保组织的稳定。在平凸透镜和组织表面间加入水，以减少样品引起的像差。非球面透镜安装在3D打印的透镜支架中，该支架连接到SMA制动器的环形驱动部件。SMA制动器安装在3D打印的物镜底盘中，该底盘还将固定平凸透镜，环氧树脂用来粘结安装的部件。

图2 SMA驱动物镜的设计。AC—制动器；AD—制动器驱动组件；LH—透镜支架；AL—非球面透镜；CL—平凸透镜；OC—物镜底盘；EP—环氧树脂[1]

最后，从动物、真菌和植物组织中获得了不同深度下TPEF、SHG和THG的多模态图像。动物软组织的成像深度超过250µm，动物骨骼、真菌和植物组织的成像深度超过150µm。由于多模态和深度扫描的能力，可以无标记地获得样品全面的信息。

在本研究中，开发了一种基于光纤激光的具有深度扫描能力的小型化多模态MPM系统。自制的掺铒飞秒光纤激光器进一步通过PPLN倍频分别为多模态成像提供了1580nm和790nm的激发波长，SMA驱动物镜来实现深度扫描，这种设计在生物医学成像方面颇具潜力并有望应用于临床。

参考文献：

[1] Wentao Wu, Qihao Liu, Christoph Brandt, and Shuo Tang, "Dual-wavelength multimodal multiphoton microscope with SMA-based depth scanning," Biomed. Opt. Express 13, 2754-2771 (2022)

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之三十 基于形状记忆合金实现深度扫描的小型化多光子显微镜