目前双光子荧光显微镜是通过振镜实现光栅式扫描成像，由于机械反射镜的惯性，采集速率被限制在每秒10–100帧。但一些活体成像需要更快的帧速率，例如神经元活动成像需要>1000 Hz的帧速率。如图1所示，本篇文章提出了一种高速的非线性显微镜，通过使用脉冲调制、快速扫频激光器和通过角色散无惯性控制光束来实现千赫兹的帧速率（每秒1000帧），作者把这种成像技术叫做衍射激发的光谱-时间激光成像(SLIDE)[1]。

图1 衍射激发的光谱-时间激光成像(SLIDE)的原理图

图2是SLIDE系统的实验装置图，光源将傅里叶域锁模(FDML)扫频激光与主振荡器功率放大器(MOPA)结构组合，来增加FDML的瞬时功率，用于非线性光学相互作用；然后使用电光幅度调制器(EOM)将1060 nm附近的FDML激光器的输出调制为短脉冲，其中每个脉冲具有不同的单色波长，进一步使用掺镱光纤放大器(YDFA)放大，YDFA可以调节瞬时功率，以达到适合非线性光学激发的状态。图2e 展示了12 nm的光谱带宽，位于大多数双光子吸收带宽内，调制后的脉冲宽度为65 ps（图2f），在光谱分析仪上测量单个脉冲的光谱带宽，拟合得到56 pm（图2g）。如图2d所示，在显微镜的部分可以看到，光源发射出波长随时间变化的短脉冲，首先通过一个衍射光栅，不同时间的脉冲顺序被分光到x轴的不同位置，从而实现x轴的快速线扫描，不受机械惯性的限制。同时用检流计式扫描振镜以1 kHz的速度（慢轴）扫描y轴（图1b）。当帧大小为256×170像素，脉冲重频为88 MHz时，最终能达到2 kHz的帧速率。

图2 SLIDE系统的实验装置图。(a)(b)(c) FDML-MOPA激光器；(d) 显微镜；(e) 光谱宽度12 nm，EOM消光比达到32 dB；(f) 脉宽65 ps；(g) 单脉冲谱线宽度为56 pm；(h) 测量得到的仪器响应函数 [1]

图3展示了 SLIDE的高速双模态成像。图3b表示使用60x物镜时，视场(FOV)测量为100×90 ?m2。图3c显示了细叶藻细胞的双光子显微镜图像，该图像在497 ?s内以2 kHz帧速率记录。每条线在2.9 ?s内采集，信噪比高达490（图3d）。如图3f所示，通过放大两个单独的像素，可以看到瞬态荧光衰减时间的差异，自发荧光叶绿体衰减快，颜色编码为红色，而尼罗河红是一种外源荧光载体，主要用来突出微藻体内的脂质生成，其衰减时间更长，颜色编码为绿色。通过对瞬态荧光衰减时间进行拟合可以提取每个像素的荧光寿命值（图3e）。

图3 SLIDE的高速双模态成像。(a) 扫描方式；(b) 测量视场；(c) 细叶藻细胞的双光子显微镜图像；(d) 信噪比；(e) 细叶藻细胞的荧光寿命成像 (FLIM)；(f) 单独像素的瞬态荧光衰减时间。比例尺：10 μm [1]

总之，该文章提出了高速SLIDE显微镜的概念，并验证了该显微镜系统在TPM和FLIM这两种成像模式中的成像能力。

参考文献：

[1] Karpf, S., Riche, C.T., Di Carlo, D. et al. Spectro-temporal encoded multiphoton microscopy and fluorescence lifetime imaging at kilohertz frame-rates. Nat Commun 11, 2062 (2020).

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之三十六 高速光谱时间编码多光子显微镜和荧光寿命成像