Boppart团队在2019年提出了无标记自发荧光多倍频 (SLAM) 显微镜，他们将激发波长设置在1110 nm，实现在单一激发条件下同时收集四个模态信号，获取FAD的双光子荧光 (2PAF)、NADH的三光子荧光 (3PAF)、胶原结构的二倍频 (SHG)以及折射率突变处的三倍频 (THG)信号。他们采用掺镱光纤激光器泵浦光子晶体光纤产生覆盖900-1200 nm的超连续谱，滤出1080-1140 nm范围内的光谱来驱动SLAM显微镜[1]。该方法成本高、结构复杂，无法长时间稳定运行，本篇文章使用YAG晶体产生超连续谱来解决这些问题[2]。

YAG-SLAM系统如图1所示，掺镱光纤激光器输出重频为2.5 MHz、中心波长为1035 nm、带宽为30 nm的350 fs脉冲 (图2(a)中红色曲线)。该脉冲通过透镜缩束后聚焦到10 mm厚的YAG晶体上产生超连续谱(图1(b))。除了近红外 (NIR) 的光谱成分外，YAG超连续谱中还包含可见光(图2(a)蓝色和绿色曲线)。产生的可见光覆盖了550 - 900 nm的光谱范围，相对于NIR具有较低的功率(< 1/500)。光路中加入长通滤波器滤除可见光防止其影响后续的成像。脉冲整形器滤出1030-1150 nm内的光谱分量用于SLAM成像，并引入了大约–8000 fs2的负色散来预补偿显微镜系统中光学元件引入的正色散。最终在样品平面上测得的脉宽为50 fs，自相关曲线如图2(c)所示。

脉冲整形器后的脉冲输入到倒置的显微镜中，显微镜通过机械平移台大范围平移样品（超过350 µm）来记录不同的视场。一对检流计式扫描振镜引导激发光对样品实现精细的光栅扫描，物镜将激发光聚焦到样品产生非线性信号。四个双色镜将不同的非线性信号引导到四个光子计数光电倍增管(PMT)中，同时检测THG、3PAF、2PAF和SHG信号。

图1 YAG - SLAM显微镜平台[2]

图2 YAG超连续谱的光学表征[2]

如图3所示，该课题组使用染色牛肺动脉内皮细胞(BPAE)以及蒸馏水气泡验证了色散预补偿对2PAF、3PAF、SHG和THG信号的影响。从图3(a)的色散预补偿前后各检测通道的图像以及图3(b)各检测通道上的光子计数可以清楚地看出，预补偿明显增强了成像对比度并获得了信噪比更高的图像。

图3 色散预补偿的评估[2]该课题组还使用YAG-SLAM系统获取了新鲜切除的肾周脂肪组织不同深度处的无标记多模态图像，如图4所示，其中黄色是2PAF，青色是3PAF，绿色是SHG，品红色是THG。THG信号来源于组织的界面处，描绘了脂肪细胞的边界。在10-30 μm的深度，可以观察到细胞周围的绿色网格，这是由于SHG模态对非中心对称分子非常敏感，能获取大分子弹性蛋白和I&III型胶原蛋白的信号。距离组织表面超过20 μm时，通过3PAF 通道可以清晰地分辨脂肪细胞。在2PAF通道可以观察到直径约为5 µm的紧密排列的圆形结构，这一信号可能来源于代谢细胞或红细胞的FAD。

图4 a) 5 μm，b) 10 μm，c) 20 μm，d) 30 μm深度下的肾周脂肪组织多模态图像[2]

这项研究提出了基于YAG晶体的超连续谱光源，该光源稳定、无需精密对准、成本低、结构简单紧凑，非常适合用来驱动SLAM显微镜，具备临床应用的潜力。

参考文献：

[1] Sixian You, Haohua Tu, Eric J. Chaney, Yi Sun, Youbo Zhao, Andrew J. Bower, Yuan-Zhi Liu, Marina Marjanovic, Saurabh Sinha, Yang Pu & Stephen A. Boppart, "Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy," Nat Commun 9, 2125 (2018)

[2] Alejandro De la Cadena, Jaena Park, Kayvan F. Tehrani, Carlos A. Renteria, Guillermo L. Monroy, and Stephen A. Boppart, "Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal," Biomed. Opt. Express 15, 491-505 (2024)

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之三十九 YAG晶体产生超连续谱驱动无标记自发荧光多倍频显微镜