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人类大脑纺锤形神经元转录图谱获解析 激光显微切割技术功不可没

中科院昆明动物研究所日前宣布,该所宿兵研究组与中南民族大学中国人类脑库中心开展合作,利用激光显微切割和微量样本RNA测序技术,解析了来源于人脑前扣带回纺锤形神经元的转录图谱。该项目得到中科院先导专项和国家自然科学基金委重点项目的资助,相关成果已发表于国际知名神经生物学刊物《Cerebral Cortex》上。

项目介绍

研究表明,旧大陆猴、猿类和人类等灵长类大脑进化出一类新的神经细胞,称为纺锤形神经元(VEN),人类大脑中的VEN数量是最多,但在新大陆猴等更原始的灵长类中则没有这类神经元存在。神经生物学家猜测VEN可能参与人类社会认知能力等的高级认知功能,但由于VEN在大脑中分布的局限(仅集中分布于前脑岛和前扣带回两个脑区)以及技术上的局限性,人们对VEN的确切功能几乎一无所知。因此,构建该类细胞的转录图谱是了解细胞功能的一个重要基础性工作。

宿兵研究组利用激光显微切割和微量样本RNA测序技术,发现了300多个VEN特异表达升高或降低的基因,并鉴定了4个新的VEN标记基因。对转录组数据的进一步分析发现,这些基因与VEN的形态发育(如树突分支和髓鞘化等)和功能(如人类社会情感类疾病等)都密切相关。人类VEN转录图谱的解析,为了解这类在灵长类大脑进化和人类大脑起源中扮演重要角色的神经元提供了重要的基础数据,也为研究人类神经精神疾病(如自闭症等)的发病机制提供了重要信息。

在这项研究中,激光显微切割技术对分离细胞、提取RNA起到了重要作用。

激光显微切割技术发展历程

显微切割技术是90年代初发展起来的一门新技术,它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞,甚至是单个细胞,再进行后续相关的分子生物学方面的研究如PCR、实时荧光定量PCR、蛋白质组学和其他分析技术。显微切割的发展经历了手动直接显微切割、机械辅助显微切割、液压控制显微切割和激光显微切割4个阶段。

激光显微切割平台

图片来自 徕卡显微系统官网

1996年,美国国立卫生院国家肿瘤研究所的首次开发出基于近红外激光熔膜原理的激光捕获显微切割技术,用于动物细胞的切割和DNA、RNA分析。次年,美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统,并实现商品化销售。又过了5年之后,激光捕获显微切割才在植物研究中成功应用,此后这一技术在生物研究中迅速发展并被广泛应用。激光显微切割技术可将显微镜下观察到的目标细胞直接用激光取出,与早期技术相比,这种技术有着快速、简单、精确、特异性强、准确度高、细胞形态保持完好、细胞内分子结构保持完整等优点。

激光显微切割原理

目前激光显微切割从激光类型和技术原理上可分为两种,分别是基于近红外激光(810nm波长)的LCM (激光捕获显微切割)和基于紫外激光(337~355nm波长)的LMD(激光显微切割)两种。前文所提的纺锤形神经元转录图谱项目,采用的就是LCM技术。

LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台(固定载玻片)的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜(乙烯乙酸乙烯酯,EVA)直径通常为6mm,覆在透明的塑料帽上,后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml离心管相匹配。

LCM技术的原理是在组织切片上方悬着机械臂控制的收集管,收集管的塑料帽表面有一层的热塑膜(其最大吸收峰接近红外激光波长),在显微镜下选择好目标细胞后,发射低能红外激光脉冲,瞬间升温使EVA膜融化与目标细胞黏合再迅速凝固。接着目标细胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并随着塑料帽一起移走。

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