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人类大脑纺锤形神经元转录图谱获解析 激光显微切割技术功不可没

机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽,放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞,发射激光脉冲,瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中,并在几毫秒内与目标细胞黏合并迅速凝固。激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒,并且可在整个塑料帽表面进行多次重复,当组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力,就可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上,分离的细胞就转移至离心管中,从而可以分析出目标细胞的分子生物学特征,用于进行后续研究。

EVA膜约100~200μm厚,能够吸收激光产生的绝大部分能量,在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C,保持数毫秒后又迅速冷却,保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。

LCM的优点在于快速、简单、精确、无污染,而且适用任何玻片类型,尤其是采用能量较低的近红外光,不直接接触样品,激光发出的大部分能量都被热塑膜吸收,对样品影响较小。

而LMD技术则需要将标本切片装片在薄膜载玻片或者薄膜覆盖的玻璃载玻片上。脉冲紫外激光(UV-A)通过物镜聚焦在切片上,沿着目标区域的边缘移动切割,使选择区域内的细胞脱离下来且周围组织完好。由于紫外激光的波长和生物组织的吸收峰非常接近,故常用于切割较厚的样品组织。

激光显微切割技术应用现状

目前,激光显微切割技术较以往的显微切割技术有了突破性的进展,现已广泛应用于神经科学、癌症研究、植物分析、法医学或气候研究等领域。该方法同时也适用于细胞培养的操作或盖玻片的显微雕刻。尽管应用日趋广泛,但也有一些问题亟待解决,例如设备成本、进行组织切片时需要通过固定和染色才能进行细胞的形态学观察,可能会影响细胞的状态以及RNA、蛋白质的变化等。

目前市场上主要有四家公司提供激光显微切割的平台,分别是美国赛默飞世尔、德国徕卡、德国蔡司和瑞士MMI,而推出世界上第一台商用激光捕获显微切割系统的Arcturus则于2010年被赛默飞世尔收购。赛默飞世尔的旗舰产品ArcturusXT是唯一将基于红外的LCM和基于紫外的LMD激光切割融为一体的显微切割仪器,而蔡司、徕卡和MMI都只能使用紫外激光对目标细胞进行切割和收集。

ArcturusXT激光捕获显微切割系统有着开放的平台,能够升级并扩展应用以满足不断变化的研究需求。例如其开放的显微镜接口能让用户修改系统,可增加高分辨率的照相机以获得更精确的影像。开放的系统设计还实现了载物台插板的轻松互换,可容纳不同的样本形式,如神经生物学研究所用的更大玻片。

徕卡提供LMD6500和LMD7000激光显微切割系统,利用紫外激光分离显微镜头之下的目标区域,并通过重力这种温和的方法来收集样品。在徕卡的两款系统中,均使用高精度的光学组件来控制激光束移动。光束焦点有自动修正功能,可在全自动模式和交互模式中切换,同时显微镜样品台和样品本身保持不动。通过这种专利方法,可以达到超乎想象的精度。

瑞士MMI公司主推CellEctor Plus单细胞分选系统和CellCut Plus激光显微切割系统,利用固态紫外激光对组织切片等样本中的目标细胞进行切割和收集。在整个分离过程中,激光都不与需要分离的样本接触,对样本损伤小,从而保证了样本RNA的完整性。此系统在样本收集时采用PTP(Predefined Target Positioning)技术,将黏性管盖划分成若干区域,对组织切片中同种类型细胞进行黏附收集,提高样品的收集效率,节省成本;通过计量统计可保证下游的核酸、蛋白实验有足够的样本量。

蔡司的PALM MicroBeam也是利用聚焦激光束来切割和分离样本,不过它收集样本的方式比较特别。通过一种激光诱导的压力波将细胞弹入管中。MicroBeam的弹射力就好像在您的样品下方发生光诱导的微型爆炸,随之而来的冲击波向上推动组织。对于较大的区域,MicroBeam也可以使用粘性管盖。

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