高帧率、高分辨、低光毒性的活体成像技术，能直接跟踪各种细胞间行为，对于生命活动的研究至关重要。无标记非线性光学显微术作为一种活体成像技术，以其非侵入性、高穿透深度、高分辨率等优点，成为神经科学、肿瘤学和免疫学研究的有力工具。

2018年，美国Boppart课题组提出了同步自发荧光多倍频显微镜技术（SLAM）：通过降低激光源的重复频率（10 MHz）、缩短脉冲宽度（＜60 fs）、调整中心波长至1110 nm，获得了相对较高的峰值功率，并可同时获取双光子荧光、三光子荧光、二倍频、三倍频（2PAF／3PAF／SHG／THG）四个模态的信号。然而，该系统仍然存在一些局限性：

1）高峰值功率导致系统中的光子晶体光纤（PCF）寿命较短（～200 小时），需要定期更换，系统操作复杂；

2）系统平均功率有限，不允许用户在很宽的范围内调整脉冲重复频率；

3）低重复频率令光电倍增管（PMT）需要每个像素均有大量激发脉冲以获得足够的信号， 限制了成像速度； 

4） 系统中使用的元器件较多，系统体积庞大且复杂。

图1 紧凑型SLAM系统示意图

为此，该课题组发展了如图1所示的紧凑型SLAM，其激发光源的中心波长移动到商业上更加成熟的1030 nm。通过使用PCF和棱镜对压缩器，可获得从变换极限60 fs到未压缩300 fs可调脉宽的激发脉冲，重复频率在800 kHz－20 MHz可调，且具有足够的脉冲能量。

这三个脉冲参数（脉冲宽度、重复频率、脉冲能量）可以独立调节，互不干扰。这使用户能够找到适合不同应用的最佳成像条件，以最大限度地提高信噪比。因为新激发波长无需产生超连续谱，PCF承受的峰值功率较低，激光源可稳定工作超过1年，无需更换 PCF。

此外，如图2所示，该系统配备了五个检测通道，利用2PAF／3PAF／SHG／THG四种模态，可同时观测新鲜生物组织内的脂质、色氨酸、NADH、胶原纤维和FAD。

图2 紧凑型SLAM系统的五个探测通道

为验证此系统，该课题组对无标记小鼠组织进行了多模态成像，结果如图3所示：虚线框内的图像是小鼠皮肤内表面富含脂肪的区域。通过4个不同的光谱通道，可清晰反映4模态的丰富信息。

其中，通道1为反映NAD（P）H信息的3PAF信号（图3b），通道2为THG信号（图3c），通道3为SHG信号（图3d），通道4为 反映 FAD 信息的 2PAF 信号（图3e）。THG 信号展现了清晰的脂肪细胞和细胞膜，SHG信号展现了丰富的纤维。4 种不同模态的合成图像则如图3a所示。

此外，图3f 和图3g分别对应每像素单脉冲和每像素20个脉冲的情况，比较两幅图像可以看出，每像素单脉冲的单帧成像能够以相对较低的信噪比揭示组织结构。如果配合高速扫描仪使用，该系统可以根据需要实现高帧率、无标记、长期并且非线性光损伤风险较低的成像。

图3 紧凑型SLAM对小鼠组织的成像结果

综上所述，本文构建了一个基于现成光学和机械组件的紧凑型 SLAM 系统［1］，该系统能够通过优化驱动光源参数提高单帧的信噪比，降低单像素停留时间或总平均帧数的要求，从而增加成像速度。脉冲重复频率、能量和脉冲宽度均可独立调节以满足不同应用。此外，激光开启后10分钟内即可用来驱动显微镜成像，且很容易补偿光纤耦合对准中的偶然漂移。最后，紧凑的设计允许将整个显微镜集成到可移动的推车中进行临床研究。

参考文献：

［1］． Geng Wang， Stephen A． Boppart， Haohua Tu． Compact simultaneous label－free autofluorescence multi－harmonic （SLAM） microscopy for user－friendly photodamage－monitored imaging． arXiv：2210．13556 （2022）．

       原文标题 : 多光子显微镜成像技术之二十五 紧凑型同步自发荧光多倍频显微镜技术